Neisseria denitrificans bakterijų mechaninio ardymo metodo tyrimas ir optimizavimas

Abstract

Remiantis mikroskopine analize, tiriamų dalelių dydžio skirstiniais bei viduląstelinių produktų koncentracijos kitimo kinetika ištirtas Neisseria denitrificans ląstelių ardymas mechaniniais metodais. Nustatyta, jog laboratoriniams (<50g) kiekiams ardyti optimalu naudoti ultragarsinį dezintegratorių, kuriuo 1g Neisseria denitrificans ląstelių efektyviai suardomas per 2,4 min, t.y. beveik 3 kartus greičiau nei rutuliniu malūnu, sunaudojant 28513 J energijos. Gamyboje savo ruožtu efektyviau naudoti naujos konstrukcijos didelio slėgio homogenizatorių - mikroskystintuvą: kuriuo 12 L/val našumu 1 g biomasės suardomas per 8,4 s sunaudojant 13749 J energijos. Didelio slėgio homogernizatorius APV, kurio našumas 9 L/val, suardo 1 g Neisseria denitrificans per 24 s. Ardymas mikroskystintuvu optimizuotas varijuojant biologinius, konstrukcinius ir išorinius faktorius. Nustatyta, jog Neisseria denitrificans sienelės struktūra yra efektyviausiai ardoma, kai ląstelės auginamos iki 1 OV, auginimo metu nepakintant viduląstelinei sudėčiai. Biologinis endoproduktų stabilumas ir aktyvumas išlaikomas ardymui panaudojus Y tipo ardymo celę ir 125–145 MPa darbinį slėgį. Lyginant su Y-tipo cele, Z-tipo celėje ląstelės suardomos efektyviau ir našiau, tačiau po suardymo pastebėtas fermentų aktyvumo sumažėjimas ir gautos mažesnio dydžio sunkiai šalinamos ląstelių nuolaužos. Pritaikius DoE eksperimentų planavimo metodą parinktos optimalios išorinių faktorių koncentracijos – buferinio tirpalo pH 9.0, 10 mM EDTA, 0,2% Triton X-100, 0,2 g/ml ląstelių koncentracija ir 90 min. preinkubacija (brinkinimas). Pritaikius optimalias ardymo sąlygas, atliktas NdeI restrikcijos endonukleazės gryninimas ir gauti duomenis palyginti su neoptimizuotos gamybos duomenimis. Gauta jog ląstelės suardytos 83% efektyviau; ląstelių nuolaužos centrifugavimo metodu šalinamos 15% greičiau ir gaunamos kompaktiškesnės; po chromatografinio gryninimo 26% didesnė NdeI restrikcijos endonukleazės išeiga, palyginti su tradiciniu gamybiniu ardymu.

Disruption of Neisseria denitrificans cells using mechanical disruption methods was investigated. Detailed monitoring of disruption efficiency was based on microscopic and particle size distribution analysis and intracellular content release kinetics. Ultrasonication, operated in batch mode, was the optimal disruption method for the laboratory-scale of cells (<50g), resulting in efficient disintegration of 1g of cells in less than 2.4 minutes, applying 28513 J of energy. In comparison, bead mill disrupted 1g of cells in more than 7 minutes. The new construction of high-pressure homogenizer - microfluidizer is more efficient in industrial-scale applications: flow rates 12L/h, 1 g of biomass is disrupted in 8,4 s using the 13749 J energy. In comparison the traditional construction of high-pressure homogenizer – APV was less efficient: flow rates 9L/h, 1 g of biomass was disrupted by 24 s, applying 15500 J energy. The efficiency of the disruption is dependent on biological, structural and external factors. Cells grown at high specific growth rates were easier to disrupt than cells grown at a lower growth rate. Furthermore, cell disruption in Z-type chamber found to be more efficient and productive, however the degradation of proteins was observed, resulting in decreased enzyme activity. Optimization of cell rupture in Y-type chamber was performed using modern DoE planning technique and optimal levels of external factors were determined- buffer pH 9.0, 10 mM EDTA, 0,2% Triton X-100, 0,2 g/mL cell concentration, and 90 minutes incubation. Optimized disruption was applied in NdeI restriction endunuclease production scheme and obtained results were compared with traditional purification scheme. Changes in flowchart resulted in 83% increased cell disruption efficiency; 15% faster (time) cell debris removal using centrifugation, precipitate was more compact; 26% increased overall yield of NdeI after chromatographic purification cycle. Based on results 20% savings in labor hours and production economics were reached due to optimized disruption.