Rekombinantinės žmogaus karboanhidrazės VII gavimas, jungimosi su slopikliais matavimas bei stabilumo charakterizavimas

Abstract

Karboanhidrazės – tai plačiai paplitę cinko metalofermentai, katalizuojantys fiziologiškai esminę reakciją – grįžtamąją anglies dioksido hidrataciją. Sutrikusi šių baltymų veikla siejama su tokiomis ligomis kaip vėžys, glaukoma ir epilepsija. Pastebėta, kad slopinant tam tikras karboanhidrazes, stebimas ligų simptomų sumažėjimas. Baltymo sąveikos su slopikliu supratimui svarbu nustatyti jungimosi termodinamiką. Darbo metu sukonstruotos dvi ekspresinės plazmidės, pasižyminčios rekombinantinio hCA VII raiška E. coli ląstelėse. Gautas aktyvus fermentas, visiškai atitinkantis UniProtKB/Swiss-Prot duomenų bazėje pateiktą hCA VII seką (P43166). Izoterminio titravimo kalorimetrijos ir terminio poslinkio metodais ištirta šio fermento jungimosi su EZA ir TFMSA termodinamika. Pagal gautus stebimuosius jungimosi parametrus, apskaičiuota baltymo pKa reikšmė, nustatyti „tikrieji“ jungimosi parametrai, nepriklausomi nuo pH ir buferinio tirpalo. Terminio poslinkio metodu įvertintas žmogaus karboanhidrazės VII terminis stabilumas esant skirtingoms pH. Darbą sudaro šešios dalys: įvadas, literatūros apžvalga, medžiagos ir metodai, tyrimo rezultatai ir jų aptarimas, išvados ir literatūros sąrašas. Darbo apimtis 68 p. teksto be priedų, 24 paveikslai, 5 lentelės, 42 bibliografiniai šaltiniai.

Carbonic anhydrases are widely-spread zinc metalloenzymes. These enzymes catalyze physiologically important reaction – reversible carbon dioxide hydration. Unbalanced activity of carbonic anhydrases is related to a variety of disorders like glaucoma, cancer and epilepsy. It was noticed that inhibition of these enzymes reduces symptoms of these disorders. It is important to determine binding thermodynamics to know interactions between protein and inhibitor. In this study two expression plasmids were created, and all of them showed expression of recombinant hCA VII in E. coli cells. The active enzyme was made, that completely correspond to hCA VII sequence (P43166) in UniProtKB/Swiss-Prot database. Thermodynamics of enzyme’s binding with EZA and TFMSA was determined by isothermal titration calorimetry and thermal shift assay. The observed thermodynamic parameters were evaluated, protonation pKa and the “intrinsic” binding parameters, independent of pH and buffer, were calculated. Thermal hCA VII stability in different pH was evaluated by thermal shift assay. Structure: introduction, literature part, materials and methods, results and discussion, conclusions, and references. Thesis consists of: 68 p. of text without appendixes, 24 pictures, 5 tables, and 42 bibliographical entries.