Geobacillus stearothermophilus NUB3621R genetic transformation by electroporation

Abstract

Background. Thermophilic bacteria of genus Geobacillus are valuable microorganisms that can be used in various biotechnological processes such as bioconversion and bioremediation. However, effective employment of geobacilli is impossible without a reliable and convenient methodology for their genetic engineering. In this study, we sought to elaborate an electrotransformation protocol for one of the most studied Geobacillus strain, G. stearothermophilus NUB3621R. Materials and methods. To determine factors influencing transformation efficiency of the strain we have changed different conditions of electro-competent cells preparation (cell growth conditions, composition of eletrotransformation media) and parameters of electroporation itself (electric field strength). Results. The best transformation efficiencies reaching 10 3 of transformants per μg of DNA were achieved when the cells were grown to OD 590 of 1.1–1.3 and suspended in hyperosmotic electrotransformation media composed of sorbitol, mannitol and glycerol. Moreover, the positive effect of MgCl 2 has been demonstrated. The electric field strength of 20–22 kV/cm was most suitable for the transformation of NUB3621R strain. Conclusions. The developed methodology allows transferring plasmid DNA to the cells of the G. stearothermophilus NUB3621R strain by electroporation. Although it is not sufficiently effective for some purposes (such like construction of DNA libraries and direct functional screening for desired enzymes), however, in this study determined conditions can serve as a starting point for further improvement of the electrotransformation protocol.

Geobacillus genčiai yra priskiriamos termofilinės bakterijos, kurioms biotechnologijos srityje skiriamas ypatingas dėmesys. Geobacilos gali būti pritaikomos įvairiuose biokonversijos ir bioremediacijos procesuose, tačiau, siekiant efektyviai išnaudoti šiuos vertingus mikroorganizmus, būtina turėti patikimą ir patogią genetinės transformacijos metodologiją. Šiame darbe mes siekėme sukurti elektrotransformacijos protokolą, tinkamą vienam iš geriausiai ištirtų Geobacillus stearothermophilus kamienų – NUB3621R. Tirdami veiksnius, turinčius įtakos elektrotransformacijos efektyvumui, mes keitėme įvairias elektrokompetentinių ląstelių paruošimo sąlygas (ląstelių auginimo sąlygas, elektrotransformacijos terpės sudėtį) ir elektroporaciją (elektrinio lauko stiprį). Geriausi rezultatai 103 transformatų mikrogramui plazmidinės DNR buvo gauti ląsteles auginant iki 1,1–1,3 OT590 vertės ir suspenduojant jas hiperosmotiniame buferyje, kurį sudaro glicerolis, sorbitolis ir manitolis. Be to, atskleistas teigiamas MgCl2 poveikis elektrotransformacijai. 20–22 kV/cm elektrinio lauko stipris buvo tinkamiausias NUB3621R kamieno transformacijai. Aprašytas metodas leidžia perkelti plazmidinę DNR į G. stearothermophilus NUB3621R kamieno ląsteles. Nors gautas efektyvumas nėra pakankamas siekiant kai kurių tikslų (pavyzdžiui, DNR bibliotekų konstravimo), tačiau darbe nustatytos sąlygos gali būti atspirties tašku toliau tobulinant elektrotransformacijos metodą.