High level expression of recombinant bovine growth hormone

Abstract

A high level biosynthesis of bovine growth hormone (bGH) was achieved in the E. coli BL21 (DE3) strain through the construction of pET21a/bGH plasmid. The plasmid carrying a sequence of bGH was used as a DNA template. The gene bGH was amplified using primers complementary to 5'- and 3'- termini. After amplification the 587bp fragment was inserted into the vector pTZ57R/T projected for direct ligation of amplified DNA fragments. [...].

Buvo sukonstruota pET21a/bGH ekspresinė plazmidė irgauta aukšto lygio jaučio augimo hormono (bGH) biosintezė E. coli BL21(DE3) ląstelėse. Kaip DNR matrica PGR reakcijoje buvo naudota plazmidė, turinti bGH geną. Genas pagausintas pradmenimis, komplementariais geno 5'- ir 3'- galams. Gautas 587 bazių porų ilgio fragmentas su suformuotais Ndel restrikcijos endonukleazės taikiniais geno galuose buvo išskirtas iš agarozės gelio ir įterptas į pTZ57R/T tarpinę plazmidę, sukurtą produktų ligavimui. Ligavimo mišiniu, transformavus E. coli BL 21 (DE3) kamieną, pasirinktas teigiamas klonas su tiksliniu fragmentu. Šis fragmentas buvo perklonuotas į pET21a plazmidę ir transformuotas į E. coli BL21(DE3) kamieną. Sekvenavimu patvirtinta,kad sukonstruotoje plazmidėje pET21a/bGH yra 576 bp nukleotidų seka, visiškai atitinkanti bGH koduojančią seką (NCBI GenBankACCNR: M57764). Atrinkti klonai ekspresavo rekombinantinį bGH baltymą indukavus 1mM IPTG. Rekombinantinis bGH analizuotas ląstelių lizate, tirpių ir netirpių baltymų frakcijose SDS-PAGE metodu. Pasiekta tikslinio baltymo ekspresija daugiau nei 30% nuo visų ir daugiau nei 60-70% nuo netirpių ląstelės baltymų.Visas jaučio augimo hormonas buvo aptiktas netirpioje ląstelės baltymų frakcijoje intarpinių kūnelių pavidalo.