Biosynthesis, purification, characterization and immobilization of laccase from Lithothelium sp.

Abstract

Novel fungal laccase isoenzymes (namely L95-1 and L95-2) produced by the Ascomycete Lithothelium sp. isolated from the forest soil were purified. However, only one of them was characterized, because the other isoenzyme lost its activity during purification. Extracellular L95-1 laccase was purified 30-fold using ion-exchange and hydrophobic interaction chromatography, with an overall yield of 88%. The molecular mass of purified L95-1 was estimated to be 85 kDa by SDS-PAGE analysis. L95-1 laccase was stable at temperature 4-22°C and pH 6.0-6.5. The substrate specificity of L95-1 laccase was examined with various compounds. Determined affinity constants (KM) varied in a wide range of 3.7-2020.0 µM, whereas catalytic efficiency constants (kcat/KM) covered a range of 0.008-1.9 µM-1 s-1. The optimum pH for most substrates varied in a range from pH 5.0 to 6.0. Sodium azide and fluoride strongly inhibited L95-1 activity, whereas sulphate salts inhibited weakly. The laccase was immobilized on the Fe3O4 nanoparticles and characterized. Residual activity remained at 20% after ten cycles of ABTS oxidation reaction. The immobilized laccase showed higher tolerance to various metal salts. The properties of L95-1 laccase make it potentially useful in the biotechnological applications.

Nauji grybinės lakazės izofermentai (pavadinti L95-1 ir L95-2) produkuojami Askomicetų Lithothelium sp.,iš-skirti iš miško dirvožemio ir išgryninti. Tačiau tik vie-nas iš jų charakterizuotas, nes kitas izofermentas gry-ninimo metu prarado savo aktyvumą. Ekstraląstelinė L95-1 lakazė buvo išgryninta 30 kartų naudojant jonų mainų ir hidrofobinės sąveikos chromatografiją, ben-dra išeiga 88 %. Nustatyta, kad išgrynintos L95-1 mo-lekulinė masė yra 85 kDa, taikant SDS-PAGE analizę. L95-1 lakazė buvo stabili esant 4–22 °C temperatūrai ir pH 6,0–6,5. L95-1 lakazės substratinis specifiškumas ištirtas su įvairiais junginiais. Nustatytos giminingumo konstantos (KM) svyravo plačiame 3,7–2020 μM diapa-zone, o katalitinio efektyvumo konstantos (kcat/KM) va-rijavo 0,008–1,9μM–1 s–1 intervale. Optimalus pH dau-gumai substratų svyravo nuo 5,0 iki 6,0. Natrio azidas ir fluoridas stipriai slopino L95-1 aktyvumą, o sulfato druskos – silpnai.Lakazė buvo imobilizuota ant Fe3O4 nanodalelių ir charakterizuota. Nustatyta, kad išlieka 20 % pradinio fermentinio aktyvumo po dešimties reakcijų ciklų ok-siduojant ABTS. Imobilizuota lakazė pasižymi didesne tolerancija įvairioms metalų druskoms. L95-1 lakazės savybės rodo potencialias galimybes panaudoti ją bio-technologiniuose procesuose.