Viduląstelinio kalcio koncentracijos reguliavimas vykdant mezenchiminių kamieninių ląstelių chondrogeninę diferenciaciją

Abstract

Žmogaus sąnario kremzlė pasižymi silpnu gebėjimu regeneruoti po kremzlinio audinio pažeidimų ir tai lemia sąnario degeneracinių ligų, tokių kaip osteoartritas, pradžią. Šiuo metu potencialiausiu būdu regeneruoti pažeistą kremzlinį audinį yra laikoma mezenchiminių kamieninių ląstelių (MKL) terapija. Tyrimuose dažniausiai naudojamos kaulų čiulpų MKL (KČMKL), tačiau dėl skausmingos invazinės jų išgavimo procedūros yra ieškoma alternatyvų, tokių kaip menstruacijų kraujo MKL (MenMKL). Vykstant MKL diferenciacijoms, svarbų vaidmenį atlieka viduląstelinio kalcio jonai [Ca2+], kurie į ląstelę gali patekti per įvairius [Ca2+] kanalus ar iš endoplazminių saugyklų. Šio darbo tikslas yra įvertinti skirtingų [Ca2+] kanalų reguliatorių įtaką KČMKL, MenMKL ir chondrocitų chondrogeninei diferenciacijai. Įvertinus visų tiriamų ląstelių fenotipą, atliekami jų gebėjimo proliferuoti tyrimai, ląsteles veikus įtampos valdomų [Ca2+] kanalų (ĮVKK) aktyvikliais bei slopikliais. Viduląstelinio [Ca2+] kiekis yra įvertinamas fluorescenciniu mikroskopu ir tėkmės citometru. Chondrogeninė diferenciacija įvertinama ląstelių sferas dažant safraninu-O, o chondroitino sulfato-tiramino hidrogeliuose vykdyta diferenciacija – žymint II tipo kolageno antikūnais. Gauti rezultatai parodė, kad skirtingų [Ca2+] kanalų reguliatoriai turi įtakos KČMKL, MenMKL ir chondrocitų viduląstelinio [Ca2+] kiekiui bei ląstelių gebėjimui proliferuoti. Ląstelių chondrogeninės diferenciacijos analizės rezultatai rodo, kad MenMKL geba stipriausiai gaminti chondrogeninei diferenciacijai būdingą užląstelinį užpildą, veikiant kalcio kanalų slopikliais kartu su TGF-β3, o KČMKL – aktyvikliu BayK8644. Mechaninis hidrogelių ir kremzlės eksplantų spaudimas paskatino užląstelinio užpildo gamybą. Todėl manoma, kad viduląstelinio kalcio koncentracijos pasikeitimas, vykstantis per įvairius kalcio kanalus, yra tiesiogiai susijęs su ląstelių diferenciacijos mechanizmų atsakais. Darbą sudaro: įvadas, 3 skyriai, išvados ir literatūros sąrašas. Darbo apimtis – 48 p. teksto, 16 paveikslų, 5 lentelės, 56 bibliografiniai šaltiniai.

Human articular cartilage has a weak ability to regenerate in case of damage, caused by trauma or degenerative joint disease (e.g., osteoarthritis, OA). Today there is no efficient and long-lasting solution discovered for OA treatment. One of the way to regenerate damaged cartilage is by using mesenchymal stem cells (MSCs). Bone marrow MSCs (BMMSCs) is a classical MSC source, however, due to invasive procedure, other sources, such as menstrual blood-derived MSCs (MenMSCs), seems an attractive alternative. Intracellular calcium [Ca2+] is known to have influence in MSCs differentiation, however, their role in stem cell chondrogenic differentiation are not elucidated. [Ca2+] can enter cells through many calcium specific channels or endoplasmic reticulum stores. The aim of this study was to evaluate association of intracellular calcium levels and different intracellular [Ca2+] channels regulation during BMMSCs, MenMSCs and chondrocytes chondrogenic differentiation. Cells were morphologicaly evaluated and incubated with different [Ca2+] channels regulators. Intracellular calcium was measured by fluorescence microscopy and flow cytometry. BMMSCs, MenMSCs and chondrocytes chondrogenic differentiation was estimated by Safranin-O staining and Collagen II antibodies. Results suggest that different [Ca2+] channels regulators contributed in the change of intracellular [Ca2+] concentration in all cells, and has influence on their proliferation capacity. During chondrogenic differentiation, MenMSCs possessed the strongest response to [Ca2+] channels antagonists, according to extracellular matrix protein synthesis. Mechanical compressure of chondroitin sulfate-tyramine hydrogels and human articular cartilage explants enhanced production of extracellural matrix proteins. These results demonstrate that intracellular [Ca2+] regulation through different [Ca2+] channels may play a role in regulation of chondrogenic differentiation. Structure: introduction, 3 chapters, conclusions, references. Thesis consists of 48 p. of text, 16 figures, 5 tables, 56 bibliographical entries.