Studies of the refolding processes of recombinant growth hormones

Abstract

The recombinant expression of proteins in E.coli cytoplasm at high concentrations often results in the formation of insoluble aggregates known as inclusion bodies. To obtain a soluble and biologically active protein, IBs must be solubilized and refolded. The proper folding of target protein in vitro competes with unproductive side reaction such as misfolding and aggregation. To prevent aggregation and increase refolding yield of correctly folded protein, low molecular weight additives are used. A great number of articles on the refolding strategies of various proteins in the presence of different solution additives have encouraged us to test these additives on two model proteins: recombinant mink and porcine growth hormones, and provide some evidence for this refolding strategy. The refolding of recombinant growth hormones from E. coli inclusion bodies at high protein concentration and pH 8.0 was impossible in the absence of the solution additives, due to a high level of protein aggregation and precipitation. Low molecular weight additives are mainly grouped into two groups: protein stabilizers and denaturants. However, there are solution additives, which are not placed in these two groups. They have only marginal effect on protein structure and stability, but appear capable to suppress the aggregation of protein. The group of aggregation suppressors includes such solution additives as L-arginine, L-arginine ethyl ester and cyclodextrins. L-arginine and L-arginine ethyl ester effectively suppressed the precipitation of growth hormones during refolding, but they did not inhibit soluble oligomers formation. Methyl-beta-cyclodextrin and 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin showed a positive effect on the aggregation suppression of both proteins. The influence of different L-arginine, L-Arginine ethyl ester, methyl-beta-cyclodextrin and 2-hydroxypropyl-beta-cyclodextrin concentrations on the renaturation yield of both proteins was investigated. Moreover, those additives did not only suppress the folding-related, but also temperature-related aggregates formation of both proteins. Since the solution additives effect on each protein was different, the main goal of the thesis was to elucidate the mechanisms by which L-arginine and cyclodextrins affect the aggregate formation of two model proteins, mink and porcine growth hormones, in two model systems: refolding from IBs and thermal denaturation.

Esant aukšto lygio rekombinantinių baltymų raiškai E. coli ląstelėse susidaro netirpūs agregatai – intarpiniai kūneliai. Norint iš jų gauti tirpų ir biologiškai aktyvų baltymą, intarpiniai kūneliai turi būti tirpdomi, o tikslinis baltymas - renatūruojamas. Baltymų renatūracija in vitro konkuruoja su šalutiniais procesais – netaisyklingai susisukusių baltymo formų susidarymu ir agregacija. Mažos molekulinės masės junginiai, naudojami renatūracijos procese, slopina baltymų agregaciją ir padidina jų renatūracijos išeigą. Apie baltymų renatūraciją esant mažos molekulinės masės priedams parašyta ne viena dešimtis straipsnių, tačiau siekiant aiškumo apie jų poveikį baltymų renatūracijos procesui, šie priedai buvo panaudoti renatūruojant du modelinius baltymus – rekombinantinius kiaulės ir audinės augimo hormonus. Rekombinantinių kiaulės ir audinės augimo hormonų renatūracija (pH 8,0) iš E.coli intarpinių kūnelių buvo neįmanoma dėl didelės baltymų agregacijos, nesant mažos molekulinės masės junginiams. Visi mažos molekulinės masės priedai skirstomi į dvi grupes: baltymų stabilizatoriai ir denatūrantai. Tačiau yra tokių priedų, kurie nepriklauso nei vienai iš šių grupių. Jie nežymiai įtakoja baltymo molekulės struktūrą, bet slopina baltymų agregaciją. L-argininas, L-arginino etilo esteris ir ciklodekstrinai yra priskiriami baltymų agregacijos slopintojų grupei. L-argininas ir L-arginino etilo esteris efektyviai slopino rekombinantinių augimo hormonų precipitatų susidarymą renatūracijos proceso metu, tačiau neinhibavo tirpių oligomerų formavimosi. Iš visų išbandytų ciklodekstrinų, tik metil-beta-ciklodekstrinas and 2-hidroksipropil-beta-ciklodekstrinas slopino rekombinatinių augimo hormonų agregaciją renatūracijos proceso metu. Ištirta rekombinatinių augimo hormonų renatūravimo išeigos priklausomybė nuo šių priedų koncentracijos. Kadangi mažos molekulinės masės priedų poveikis įvairiems baltymams skirtingas, todėl šio darbo tikslas buvo ištirti dviejų modelinių baltymų, rekombinantinių audinės ir kiaulės augimo hormonų, agregaciją, slopinančių priedų, L-arginino ir ciklodekstrinų, veikimo mechanizmą dviejose modelinėse sistemose: renatūracijos iš intarpinių kūnelių bei terminės denatūracijos.